全长转录本测序基于单分子实时测序Pacbio Sequel平台，超长读长可获得mRNA全长序列及完整结构信息。克服无参考基因组物种转录本拼接短、信息不完整的难题，实现有参考基因组物种研究可变剪切及融合基因等结构变异。
技术优势
平台优，质量好，性价比高。
基于小而强大的Pacbio Sequel平台，获取mRNA全长序列，
文库构建时无需将转录本打断，信息分析无需组装，精准重构转录组全貌。
科学方案设计：从材料选取，建库测序，到数据分析，每一步都需要科学、缜密的设计，以保障高质量研究成果.
技术路线
分析内容
样本类型
由于是测全长，所以比二代转录组测序实验对RNA质量的要求更高。
样品量：总RNA>5 ug/文库；总量>15 ug（3个文库）；
样品纯度：OD260/280≥1.8，OD260/230≥1.0，260nm处有正常峰值；
RNA 完整性：总RNA的RIN值≥8.0，28S/18S≥1.3；图谱基线无上抬；5S峰正常
Q1：全长转录组测序中，为什么要建3个以上文库？
A：全长转录组采用单分子实时测序技术，通过构建哑铃型文库，以环形方式循环测序。测序时，短片段文库更容易落入零模波导孔。为了避免测序过程中短片段文库偏好性，保证不同长度转录本的覆盖度，因此，会构建3个或3个以上文库。
Q2：全长转录组是否需要打断，拼接？
A：全长转录本是包括从5`末端到3`-poly A tail的，包括mRNA全长序列以及完整结构信息的完整转录本，片段集中分布于1-6kb，sequel平均读长在12kb左右，最长的文库都可以测至少一遍，所以建库前不需要打断，后期分析也无需拼接，得到的就是完整的mRNA。
研究背景
高粱是世界上非常重要的C4作物，也是重要的耐胁迫的谷类，重要的研究非生物胁迫的模式生物。本研究以高粱为研究材料，采用Pacbio的Iso-Seq策略，调研高粱转录组特征，改进高粱基因集注释。
研究结果
1. AS事件分析
本研究发现，有10,053个isoform经历了AS事件，其中只有2,950个isoform和现有的基因模型吻合。Pacbio数据结果证实高粱转录组AS事件比之前的认知更为普遍。同时，文章对在Pacbio中的多isoform的基因做了RT-PCR验证，证实了结果的可靠性。
2. APA事件分析
APA事件是在编码区或3’-UTR区形成isoform，提高转录本的复杂性。由于单分子测序技术利用Oligo dT引物合成cDNA，poly(A)会出现在测序结果中。因此，单分子测序技术是研究APA的有力工具。本文发现在已表达的14,550个基因中，11,013个至少有1个poly(A)位点。
3. 新基因发现
原来的参考基因集有~34,500个基因。在该研究中预测到2171个可能的新基因。为了鉴定这些新基因是否在其他物种中存在，我们使用BLAST中的tblastx和blastx分别比对到收集的植物cDNA序列和Swiss-Prot蛋白数据库，共检测到971个基因。为了证明这些新基因的表达，随机选择7个基因并用RT-PCR验证，证实了新基因的表达和剪切。
图 Iso-seq和已注释的不同可变剪切类型的比较
参考文献
Abdelghany S E, Hamilton M, Jacobi J L, et al. A survey of the sorghum transcriptome using single-molecule long reads[J]. Nature Communications, 2016, 7:11706.
